FIX: Corrige El Error De PCr Adecuado Para Cintas Pequeñas No Especificadas

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El directo de hoy está diseñado para ayudar a alguien si recibe el mensaje de error “Solucionar problemas de PCR para bandas pequeñas no específicas”.La calidad estimada y los niveles de dNTP están estrechamente relacionados con la eficiencia de la amplificación por PCR. Si la fuerza es demasiado grande, pueden aparecer líneas inespecíficas. Además, el dNTP a veces se puede combinar con Mg2+ para reducir la concentración de Mg2+ complementario.

Tiempo de viaje y motivos de frialdad Muy pocos bucles considerados El uso de demasiadas bicicletas PCR puede resultar en una amplificación insuficiente. Utilice de 20 a 35 ciclos. No use más ciclos cuando la concentración en su modelo sea particularmente alta y dependa de más ciclos cuando la concentración en la estructura sea baja. El tiempo de renovación también venció Si el tiempo de actualización es increíblemente trivial, se está quedando sin instante para replicar completamente el objetivo. Como regla general, utilice un tiempo ext de 1 min/kb/s. El brillo se acabó básicamente del corto Si nuestro tiempo de recocido es demasiado corto, los cebadores más importantes no tendrán tiempo para permitir que se adhieran al modelo. Utilice cualquier tiempo de brillo de al menos 29 segundos. Temperatura de recocido demasiado alta Si la temperatura de recocido es sin duda demasiado alta, las imprimaciones no pueden unirse en la ruta del sello. En importante, se debe utilizar una temperatura de recocido 5 ° C inferior a la del 101. Para evaluar su imprimación T m , utilice la herramienta en www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html con una concentración estándar marina funcional y una reacción alérgica de 0,2-1 μM 101 ( dependiendo del tema de su aplicación). Al calcular el tipo particular de temperatura de recocido, utilice el cebador T m más bajo. Para una precisión más amplia, puede optimizar la temperatura de recocido utilizando un gradiente de rango de temperatura completamente nuevo. Si la T u del cebador se aleja de 5 °C cerca del rango de temperatura (72 °C), considere un protocolo de PCR de dos pasos. La temperatura de inicio no debe superar la temperatura de formato. La temperatura de desnaturalización fue demasiado corta Si la temperatura de desnaturalización es increíblemente baja, el ADN no desnaturalizará para siempre la amplificación y la productividad del trabajo también será baja. Utilizar desnaturalización a 95 °C. El tiempo de desnaturalización fue demasiado largo Si el tiempo de desnaturalización suele ser demasiado largo, es posible que el ADN esté inflado. Para desnaturalización inicial 3 minutos desde 95°C; usar 0 momentos a 95°C para producir desnaturalización por 3 ciclos. El tiempo de desnaturalización fue demasiado corto Si normalmente el tiempo de desnaturalización es demasiado corto, mi ADN no se desnaturalizará perfectamente y, además, la eficiencia de la amplificación será baja. Para la desnaturalización inicial, invierta en al menos 3 piezas para seleccionar la polimerasa; Por lo general, desnaturalice la plantilla con respecto al ciclismo, use veintinueve segundos.

Motivos relacionados para asistirlo con los componentes de PCR La concentración de dNTP también ha sido alta Si la concentración total de dNTP es demasiado excepcional, hay una disminución de Mg 2+ … Generalmente, el DNTP debe tratarse con 200 μM por reacción. La concentración de dNTP era realmente baja Cada dNTP probablemente estará presente en la reacción general a una concentración de 210 μM. El producto PCR necesita un alto contenido de GC (> 65 %) Los productos de PCR enriquecidos con GC son muy difíciles de amplificar. Para mejorar dramáticamente la ganancia, aumente la temperatura de recocido. Para una mayor precisión, optimice el calor en relación con la curación con un gradiente de temperatura. Puede agregar DMSO u otro buen desestabilizador de la estructura secundaria (no mucho más del 10%). El modelo estaba realmente dañado o degradado debido a los inhibidores La plantilla se puede cortar y puede contener inhibidores de PCR. Si se sospecha incuestionablemente de inhibidores, diluir la matriz; si no es elemento, use un Internet nuevo y suba los ciclos. Intente impulsar una reacción de eliminación usando un plásmido puro en un motivo completo agregado para saber si hay algún resultado inhibitorio. Los imprimadores contienen impurezas Los cebadores contaminantes pueden interferir permanentemente con la PCR. Imprimadores usados ​​desmineralizados o posiblemente más cosechados. Sin esfuerzo intentan diluir en los cebadores disponibles para ver si ahora hay un efecto inhibidor, pero agregan menos en comparación con 0,02 μM relacionados con cada cebador. La respuesta no soy lo suficientemente elegante Si la cantidad original, incluido el patrón, es definitivamente demasiado pequeña, la ganancia debería ser insuficiente. Aumente el número de ciclos de audio por lotes en 5 o, si es creíble, aumente el número de plantillas. dNTP impuros utilizados Es probable que los contaminantes de la mezcla de dNTP ayuden a que la PCR se cuelgue o amplifique de forma incompleta o incorrecta. Utilice dNTP de primera calidad. El conocimiento básico parecía ser demasiado alto El uso de una mayor concentración de cebadores puede aumentar las posibilidades de una persona de que los cebadores se eliminen de forma no específica, para enlazar sitios web no deseados en la plantilla y/o posiblemente entre sí. Para una respuesta más confiable, use cebadores bien formulados disponibles en el rango de 0,2 a 1 metro. Asegúrate también de que el nivel sea el indicado por algún fabricante. Concentración de imprimación demasiado reducida Si el énfasis de la imprimación específica también es bajo, el recocido puede resultar ineficaz. Para la última reacción, implemente cebadores de 0,2–1 µm bien diseñados. También asegúrese de que la concentración se haya proporcionado a nuestro fabricante. La fuerza de la enzima también era baja Si la concentración particular de polimerasa total es demasiado reducida, es obvio que no todos los productos de PCR se duplicarán por completo. La concentración óptima de enzima depende de la longitud y complejidad de cada modelo. Los cebadores fueron creados y creados incorrectamente por el usuario al fabricante Asegúrese de que todos los cebadores estén en el orden correcto mientras complementan el patrón. Use un programa de diseño 101 para contrarrestar series repetitivas, regiones de alta complementariedad, etc. Realice una búsqueda BLAST para escapar de los cebadores que pueden aumentar los pseudogenes o regiones aleatorias cruciales. Utilice la herramienta a través de www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html para reabastecerse con una concentración de sal de referencia, así como junto con una imprimación de 0,2-1 μM (dependiendo de las mejores condiciones) para evaluar T m. Utilice este primer con la T m más pequeña. El objetivo era realmente demasiado largo Las concentraciones dentro de los componentes de la PCR y/o las condiciones de obtención pueden no ser suficientes como forma de generar secuencias diana más largas. Optimice una visualización particular del protocolo de ensayo y, además, alargue la duración dentro de los pasos de PCR, incluido el paso de negación. El agua no era segura No hace mucho tiempo, es posible que el chorro se haya contaminado dentro del pipeteo. Use agua fría y libre de nucleasas. No Mg 2+ Falta o posible ausencia de magnesio final en una o más piezas de PCR. Utilice 1,5 mM para la reacción de cantidad específica.

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