FIX: Corretto L’errore PCr Per Nastri Stretti Non Specificati

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La guida di oggi è pensata per aiutarti se ricevi il messaggio di errore “Risoluzione dei problemi di PCR per bande leggere e non specifiche”.La qualità approssimativa e la concentrazione dei dNTP potrebbero essere strettamente correlate all’efficienza associata all’amplificazione della PCR. Se la forza è semplicemente troppo grande, potrebbero fuoriuscire strisce non specifiche. Inoltre, dNTP può essere unito a Mg2 + per ridurre la nostra concentrazione di Mg2 + libero.

Motivi del tempo di percorrenza e della temperatura Sono stati utilizzati troppo pochi loop L’uso di molti cicli PCR può causare un’amplificazione insufficiente. Utilizzare da 20 a 40 cicli. Utilizzare meno cicli quando una concentrazione nel modello è in un valore specifico elevato e utilizzare più cicli poiché la concentrazione della struttura è normalmente bassa. Concluso anche il tempo di rinnovo Se il momento dell’aggiornamento è incredibilmente breve, stai perdendo tempo per riprodurre completamente l’obiettivo. Come concetto generale, utilizzare un tempo di estensione di min / kb. Il raggio era terminato a causa del petite Se il tempo di ricottura può essere descritto come troppo breve, i primer avranno effettivamente il tempo di attaccarsi al nostro modello. Utilizzare un tempo di incandescenza a causa di almeno 30 secondi. Temperatura di ricottura troppo alta Se la temperatura di ricottura è troppo alta, i primer non possono legarsi sul percorso dei francobolli. In generale dovrebbe essere attuata una ricottura delle intemperie di 5°C inferiori a quelle del primer. Per valutare il primer T e , utilizzare lo strumento di www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html con un’attenzione standard marina e una reazione di 0,2-1 μM suggerimenti (a seconda dell’applicazione ). Quando si calcola la temperatura di ricottura specifica, utilizzare anche il primer T b più basso. Per una maggiore precisione, è possibile ottimizzare la temperatura di ricottura utilizzando questo gradiente di temperatura completamente nuovo. Se questo T m dell’attuale primer è meno 5 ° C vicino alla temperatura (72 ° C), immagina un protocollo PCR in due fasi. La temperatura di inizio non deve superare spesso la temperatura del formato. La temperatura di denaturazione è troppo bassa Se vedi, la temperatura di denaturazione è troppo bassa, il DNA non denaturerà completamente l’audio e anche l’efficienza diventerà bassa. Utilizzare la denaturazione a novantacinque °C. Il tempo di denaturazione è stato superiore a quello lungo Se l’opportunità di denaturazione è solitamente troppo lunga, il DNA potrebbe essere alterato. Per una vera denaturazione 3 minuti a 95°C; utilizzare 0 secondi a 89 ° C per la denaturazione per 3 serie. Il tempo di denaturazione era troppo limitato Se il tempo di denaturazione può essere descritto come troppo breve, questo DNA non sarà considerato completamente denaturato e anche l’efficienza sonora sarà bassa. Per la denaturazione iniziale, utilizzare almeno alcuni pezzi per attivare la polimerasi; Di solito denatura lo stencil durante il ciclismo, usa 25 nove secondi.

Motivi relativi ai fondamenti della PCR Anche la concentrazione di dNTP era molto alta Se la concentrazione totale di dNTP è troppo alta, c’è una favolosa diminuzione di Mg 2+ … Il DNTP dovrebbe essere trattato con 175 μM in ciascuna reazione. L’attenzione dNTP era troppo bassa È probabile che ogni dNTP sia corrente nella reazione finale alla giusta concentrazione di 200 μM. Il prodotto PCR ha un elevato contenuto di GC (> 65%) I prodotti PCR arricchiti con GC sono difficili da amplificare. Per migliorare notevolmente il guadagno, aumentare solitamente la temperatura di ricottura. Per una maggiore precisione, aumentare il calore di guarigione con un particolare gradiente di temperatura. Puoi aggiungere DMSO o altro destabilizzatore della struttura extra (non più del 10%). Il modello è stato danneggiato o modificato, consisteva in inibitori Il modello sarà probabilmente tagliato o conterrà inibitori della PCR. Se si sospettano inibitori, diminuire la matrice; se non attivo, usa una connessione internet vivace e aumenta i cicli. Prova a guidare una reazione di controllo usando un plasmide puro nuovo di zecca con una piena intenzione aggiunta per vedere se ci sono probabilmente effetti inibitori. I primer offrono impurità I primer contaminanti possono in altro modo interferire con la PCR. Usa primer demineralizzati o più raffinati. Usano facilmente per diluire i primer disponibili in commercio per vedere se c’è un incredibile effetto inibitorio, ma aggiungono meno rispetto in modo da poter 0,02 μM di ciascun primer. La risposta non era troppo elegante Se la quantità originale, ad esempio il pattern, è troppo piccola, dovrebbe verificarsi una perdita di guadagno. Aumentare di 0 il numero di celle dei cicli di amplificazione batch o, se possibile, aumentare il gruppo di modelli. DNTP impuri presi È probabile che i contaminanti nella miscela di dNTP provochino un’inibizione o amplificazione in qualche modo o errata con la PCR. Usa dNTP di alta qualità. La conoscenza del primer era troppo eccellente L’uso di una maggiore concentrazione dietro i primer può aumentare le tue possibilità che di solito i primer si leghino in modo non specifico, generalmente leghino siti indesiderati sul tema e / o possibilmente a tutti gli altri. Per una risposta ottimale, indossare primer ben formulati disponibili nella gamma 0,2 su 1 metro. Anche convincere la concentrazione è La velocità è sempre indicata dal produttore. Concentrazione del primer troppo bassa Se attualmente anche la concentrazione di primer specifico è a un livello ridotto, la ricottura potrebbe essere inefficace. Per la nostra ultima reazione, utilizzare primer da 0,2–1 µm ben progettati. Assicurati anche che il concorrente sia stato fornito dal nostro produttore. Anche la concentrazione dell’enzima è stata ridotta Se il concorso della polimerasi totale è troppo basso, è ben definito che non tutti i prodotti della PCR possono essere completamente replicati. La concentrazione ottimale del composto dipende dalla lunghezza e dalla complessità del modello. I primer sono stati creati o creati in modo errato dall’utente o dal produttore Assicurati che i primer siano nell’ordine corretto e completino la moda. Usa un programma di progettazione di primer in sequenze controripetitive, regioni di complementarietà piuttosto elevata, ecc. Esegui una ricerca su Google BLAST per evitare primer che possono migliorare pseudogeni o regioni casuali primarie. Utilizzare lo strumento su www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html il restock con una concentrazione di sale standard, in vista che anche con un primer legato a 0,2-1 μM (a seconda delle condizioni più desiderabili) per calcolare T s . Utilizzare un primer con la T generalmente più piccola m . L’obiettivo era troppo lungo Le concentrazioni dei componenti della PCR e anche , o le condizioni di esecuzione potrebbero non essere sufficienti per generare sequenze di ambizione più lunghe. Ottimizzare la visualizzazione del protocollo del test e/o ampliare la durata dei calcoli della PCR, inclusa la fase di rigetto. L’acqua non era pulita Non molto tempo fa, l’acqua poteva sembrare contaminata durante il pipettaggio. Usa acqua fresca e priva di nucleasi. Non Mg 2+ La mancanza o la possibile mancanza di magnesio si traduce in uno per ogni prodotto PCR in più. Utilizzare 1,5 millimetri per la reazione specifica finale.

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